肝癌轉移的引路人——lncRNA AY
欄目:最新研究動態 發布時間:2019-07-31
關于腫瘤轉移轉移的驅動分子仍有許多未知之處。在此,我們的目的是鑒定出對人類肝癌(HCC)的轉移至關重要的長鏈非編碼RNA(lncRNA)......

  關于lncRNA與癌癥之間的研究是近年來的熱點,對于常見的癌癥如肝癌、胃癌等,研究者們投入了大量的時間和精力,研究其生長、轉移,侵襲的機制,以期找到治愈它們的有效辦法。今天小編就給大家帶來了今年三月,Dr. Liang Yang等人在雜志《Theranostics》上發表的題為“LncRNA AY promotes hepatocellular carcinoma metastasis by stimulating ITGAV transcription”的一篇文章,IF=8.063。 文章介紹了作者如何一步步證明lncRNA AY通過誘導ITGAV轉錄的染色質修飾作為先導因子促進HCC轉移的,同時指出lncRNA AY是HCC患者轉移或預后不良的潛在分子標志,這對HCC的治療有著重要的臨床意義。
實驗結果:
1.LncRNA AY927503在HCC細胞中高表達     
  研究者使用ArrayStar lncRNA芯片V2.0比較硫脂處理的HCC細胞和對照細胞的lncRNA圖譜,觀察到了一組全面的差異表達的lncRNA。
  在53對肝癌和鄰近的非腫瘤(NT)標本隊列中,肝癌組織的AY表達明顯高于癌旁NT組織(P<0.001,圖1A,a&b)。在另一組80例HCC患者中,原位雜交分析顯示HCC組織中每個細胞的AY信號明顯高于鄰近NT組織(P<0.01,圖1B,a)。與T1和T2期患者相比,T3和T4期HCC患者的AY信號增加(P<0.05,圖1B,b)。隨訪患者(n=64)的生存分析顯示,低AY表達的患者比高AY表達的患者存活時間長(P=0.034,圖1B,c&d)。腫瘤大小(>3 cm)的患者AY水平高于小腫瘤患者(P<0.05,圖1B,e)。有血管腫瘤栓阻的患者AY水平高于無腫瘤栓阻的患者(P<0.05,圖1B,f)。分析來自腫瘤基因組圖譜(TCGA)肝癌數據庫的數據可以得出,肝癌組織與其配對NT組織相比,AY表達升高(P<0.001,N=248,圖1C,a)。Kaplan-Meier生存分析顯示,高AY水平與肝癌患者的總生存率差密切相關(N=180,P=0.0014,圖1C,b)。AY在乳腺(N=837)、腎臟(N=448)、肺(N=488)和肝組織中廣泛表達,AY在腫瘤中的表達高于正常組織(圖1D)。AY在MHCC97H(高轉移潛能)HCC細胞中的表達明顯高于MHCC97L(低轉移潛能)HCC細胞(P<0.05,圖1E,a)。

說明: C:\Users\y505\Desktop\LncRNA AY promotes hepatocellular carcinoma\F1.tif

2.AY促進ITGAV表達     
  已證明硫脂通過整合素αVβ3上調ITGAV促進肝癌的轉移。分析7種肝癌細胞株和人肝細胞LO2細胞株中AY和ITGAV的表達水平。AY在Hep3B、HepG2、LM3、SMMC-7721、Huh7、LO2、BEL-7404和SK-Hep1細胞中的表達譜與ITGAV相似,可發現AY和ITGAV表達水平之間存在密切的正相關(皮爾遜相關系數r=0.8729,圖1E,b-d)。分析53例HCC患者組織標本中AY和ITGAV mRNA的表達水平,53例HCC組織中有36例顯示AY水平明顯高于鄰近NT組織(P<0.01,圖1A,c)。在36個樣本中,33個也表達高水平的ITGAV。17個HCC樣本中有5個AY水平低于鄰近NT組織,ITGAV水平也較低(圖1A,d)。皮爾遜卡方(χ2)檢驗結果顯示,AY和ITGAVmRNA表達水平之間存在顯著相關性(P<0.0 5)。TCGA數據分析顯示AY和ITGAV表達水平密切相關(N=122,P<0.0001,圖1C,c)。在過度表達AY的HCC細胞中,ITGAV mRNA水平幾乎增加了兩倍,但敲除AY使ITGAV mRNA水平急劇降低(圖2A)。在過度表達AY的HCC細胞中,ITGAV蛋白水平也增強,并且與對照細胞相比,AY敲除細胞中的ITGAV蛋白水平顯著降低(圖2B)。免疫熒光分析顯示,在過度表達AY的肝癌細胞中,ITGAV和整合素αVβ3在細胞表面的表達明顯增加,而在AY敲除細胞中則下降(圖2C)。
說明: C:\Users\y505\Desktop\LncRNA AY promotes hepatocellular carcinoma\F2.tif

3.AY促進肝癌細胞的轉移相關行為     
  血管生成是腫瘤轉移的重要因素,與整合素αVβ3相關,研究者進行管腔形成實驗來研究AY在血管生成中的作用。過表達AY的人臍靜脈內皮細胞(HUVECs)顯示明顯多于模擬細胞的分支點(血管生成的指標)(P<0.01,圖3A)。敲除ITGAV可消除AY在HUVECs中的血管生成作用且使分支點減少到低于對照組的數目。ITGAV的過表達能恢復HUVECs的分枝能力。在轉染AY的細胞中形成的菌落數量明顯多于模擬細胞。與擾亂對照相比,沉默AY的細胞中的菌落數量明顯減少(圖3B,a)。AY的過表達顯著增加了細胞活力(圖3B,b),敲除ITGAV消除這種AY效應。在Hep3B細胞中,敲除AY顯著降低了細胞活力,轉染ITGAV或AY構建挽救了細胞活力(圖3B,b)。
  EMT是HCC中使腫瘤細胞遷移和轉移的重要過程。AY顯著降低E-cadherin的表達水平,并提高N-cadherin、ZEB1或Twist的水平(圖3C,a&b)。這些AY效應被ITGAV敲低所消除。相反,敲除AY促進E-cadherin,但抑制N-cadherin,vientin,ZEB1和Twist表達,ITGAV過表達逆轉了這一效應(圖3C,a&b)。AY的過表達增強了干細胞標志物OCT4和SOX2的表達,這種效應被ITGAV敲低所消除(圖3d,a&b)。AY沉默則情況相反。2μM 5-氟尿嘧啶(5-FU)處理的細胞與對照細胞相比,AY表達明顯降低(P<0.0 1,圖3E,a&b);與模擬組相比,2μM 5-FU處理的細胞活力因AY的過表達而顯著增強,因ITGAV的沉默而降低(圖3e,c)。AY敲除顯著抑制了5-FU處理的Hep3B細胞的細胞活力,但AY或ITGAV的過表達在48小時后完全恢復了細胞活力(圖3E,d)。過量表達AY的HepG2細胞的5-FU半數抑制濃度(IC50)明顯高于對照細胞。 敲除AY可顯著降低5-FU在Hep3B細胞中的IC50(圖3E,e&f)。

說明: C:\Users\y505\Desktop\LncRNA AY promotes hepatocellular carcinoma\F3.tif

說明: C:\Users\y505\Desktop\LncRNA AY promotes hepatocellular carcinoma\F3-2.tif

4.AY促進HCC轉移     
  利用腫瘤異種移植,研究lncRNA AY在體內對腫瘤生長和轉移的影響?;贏Y和ITGAV水平,選擇穩定的AY過表達(AY4)和對照(M6)細胞進行腫瘤異種移植實驗(圖4A)。將AY4或M6細胞(5×106細胞)皮下注射給4周齡雌性BALB/c裸鼠(n=10/組),觀察腫瘤大小,發現AY組的腫瘤明顯大于對照組(圖4B)。AY組的AY和ITGAVmRNA水平高于對照組,并且ITGAV和整合素αVβ3(圖4C,a和b)的染色比對照組強。AY組腫瘤組織陽性CD31(血管內皮細胞標記物)染色高于對照組(圖4D,a)。在AY組的Matrigel-plug中也觀察到比對照組更多的CD31陽性細胞(圖4D,b)。AY組肝和肺轉移灶也明顯多于對照組(圖4E)。在AY組肝轉移組織中ITGAV染色比對照組更強烈(圖4F)。
說明: C:\Users\y505\Desktop\LncRNA AY promotes hepatocellular carcinoma\F4.tif

5.AY增強ITGAV基因轉錄     
  在HCC細胞中進行原位雜交分析,觀察到AY定位在細胞核或細胞質中(圖5A,a)。通過RNA純化(Chirp)分離染色質的實驗,以使用生物素化的AY來拉低超聲剪切的基因組DNA,發現ITGAV啟動子是AY復合體的一部分(圖5B),這表明AY與ITGAV啟動子相互作用。使用全長ITGAV啟動子(-1295至+207)進行熒光素酶報告分析,以研究AY對ITGAV啟動子活性的影響(圖5A,b)。AY過表達顯著刺激了SMMC7721(P<0.001),HEK293T(P<0.001)和HeLa(P<0.001)細胞的ITGAV啟動子活性(圖5A,c),這些細胞中的AY敲除顯著降低了ITGAV啟動子的活性(圖5A,d)。全長AY不增強酪氨酸羥化酶(TH)或pGL3啟動子活性(圖5C,d),這表明AY特異性調節ITGAV啟動子活性。
  AY結構域缺失實驗(圖5D)發現突變體5(1-671)和4(1-522)顯示增強的ITGAV啟動子活性,類似于全長AY(圖5C,a&b),但突變體2(1?371)和1(1?298)在HEK293T和SMC-7721細胞中均未顯示出增強的ITGAV啟動子活性。突變體3(1?401)表現出部分刺激效應。這些結果表明,AY的371-522結構域對于AY對ITGAV啟動子活性的調控具有重要作用。突變體AYΔ371-522缺乏371-522結構域,沒有顯示AY誘導的ITGAV啟動子活性(圖5C,c)。單獨過表達AY的371-522片段或AY?371-522 序列均不能刺激 ITGAV啟動子的活性和轉錄。只有當全長AY過表達時,才在BEL-7404和SMMC-7721細胞中檢測到ITGAV的表達(圖5E,a&b)。ITGAV蛋白表達也觀察到類似的結果(圖5E,c)。此外,無論是AY?371-522還是AY371-522都不能單獨促進傷口閉合率(圖5E,d)。

說明: C:\Users\y505\Desktop\LncRNA AY promotes hepatocellular carcinoma\F5.tif

6.AY與鏈接蛋白H1FX相互作用      
  RNA免疫沉淀(RIP)和RNA下拉分析顯示AY與已知對ITGAV表達重要的因素(8,9,21)之間沒有顯著的相互作用。在這兩種方法中,沒有發現AY與ZNF282的相互作用(數據未顯示)。通過質譜和高通量蛋白質芯片實驗,篩選與AY相關的蛋白質。通過質譜和蛋白芯片分析鑒定組蛋白1FX(H1FX)和Ig kappa鏈C區(IGKC)。IGKC被排除在進一步的分析之外。RNA下拉試驗顯示AY和H1FX之間存在直接相互作用(圖6A,a)。在由奇數或偶數AY探針池拉下的復合體中也觀察到H1FX(圖5B)。在其他六個組蛋白H1變異體中,H1.2、H1.3和H1.4與AY在復合物中沉淀,但H1.0、H1.1和H1.5沒有(圖6A,a)。H1FX、H1.2、H1.3和H1.4也與AY371?522結構域相互作用(圖6A,b)。在AY缺失突變體AY?371?522中,共沉淀復合體中H1FX水平明顯降低,但與包含全長AY的沉淀相比,H1.2,H1.3或H1.4水平保持不變。結果表明AY(371?522)的中心結構域與H1FX相互作用。
說明: C:\Users\y505\Desktop\LncRNA AY promotes hepatocellular carcinoma\F6.tif

7.AY與H1FX結合誘導染色質重構     
  使用五對引物通過染色質免疫沉淀分析測試了ITGAV啟動子的H1FX占有率(圖6B,a)。H1FX不僅在-1241到-677之間占據了ITGAV啟動子區域(圖6B,b),而且在內含子1和外顯子1和2上也被觀察到。
  RNA聚合酶II(Pol 11)占據了內含子1和上游區域從-894到-492(圖6B,d)。Ay過表達顯著增加了pol II在上游區域的占有率,但內含子1和上游區域從-894到-492的H1FX占有率顯著降低(圖6B,c&e)。啟動子上H3K27me3(一種含有三甲基化賴氨酸27殘基的組蛋白H3)占有率降低(圖6C)。AY顯著增強了ITGAV啟動子上H3K4me3和acH3K9/14的占有率(圖6C)。H1FX沉默消除了AY過表達對ITGAV啟動子的刺激(圖6D,a)。H1.2,H1.3或H1.4的沉默對ITGAV的表達沒有任何影響,由于AY過表達,它們在ITGAV啟動子上的占有率沒有改變(圖6D,a&b)。這些結果表明AY與H1FX相互作用誘導ITGAV啟動子上的核心組蛋白修飾。
8.AY誘導的核心組蛋白修飾排斥H1FX結合
  連接組蛋白與DNA/核小體的結合是由組蛋白伴侶蛋白實現的。通過質譜,發現組蛋白1伴侶核仁蛋白(NCL)是AY復合物的一部分。核糖核酸下拉試驗顯示NCL與全長AY和突變的AY(AY371-522,AY?371-522)相互作用(圖6A)。AY的過表達顯著降低了ITGAV啟動子上NCL的富集(從-894到-492)(圖6D,b)。NCL的沉默也減弱了AY對ITGAV轉錄的刺激作用(圖6D,a)。AY的異位表達顯著增強了組蛋白乙?;D移酶PCAF(acH3K9/14的組蛋白乙?;D移酶)的占有率,但減少了組蛋白去乙?;窼IRT1在ITGAV啟動子區域-894到-677的富集(圖6e)。來自芯片序列的數據確實表明SIRT1和PCAF被結合在ITGAV位點上(圖6F)。結果表明,AY招募組蛋白修飾酶并誘導區域組蛋白修飾,從而排斥NCL/H1FX結合并激活ITGAV啟動子。

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