外泌體 miR-301a TCEAL7 Wnt/b-catenin信號通路
欄目:最新研究動態 發布時間:2019-10-14
在'外泌體'的概念發展以前,科學家就對血清/血漿/體液中的核酸已經有了一定的研究......

在'外泌體'的概念發展以前,科學家就對血清/血漿/體液中的核酸已經有了一定的研究,當時將這些核酸統稱為循環核酸(Circulatingnucleic acid)。miRNA作為循環核酸中的一種,miRNA調控基因表達,exosome是細胞外運輸工具遞送miRNA和其他物質到達細胞周圍。exosome通過受體細胞吸收,釋放miRNA,是癌癥發展、遷移的潛在原因之一。miRNA與靶mRNA的結合,可導致miRNA在蛋白質翻譯水平上抑制靶基因表達或降解,從而靶基因引起下游信號通路的變化。這是一種常見的研究外泌體思路。所以,循環miRNA的研究一直以來都是miRNA研究的重要方向之一。
幾乎所有人類實體瘤都暴露于微環境因素如缺氧,缺氧通過促進癌癥和基質細胞生物學的各種變化而在腫瘤進展和對治療的抗性中起重要作用,腫瘤缺氧是抗癌失敗的主要因素。腫瘤缺氧可以降低常規療法的有效性,例如放射療法。7月份,X Yue等人發表一篇 “Hypoxic Glioma Cell-Secreted Exosomal miR-301a Activates Wnt/b-catenin Signaling and Promotes Radiation Resistance by Targeting TCEAL7 ”的SCI文章,發表雜志為:Molecular Therapy ,這項研究主要發現了缺氧膠質母細胞瘤(GBM)細胞釋放的外泌體 exo-miR-301a通過調節Wnt/b-catenin信號通路干擾放射治療的敏感性。
技術路線:

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結果:
一、缺氧GBM細胞特異性表達和分泌exo-miR-301a
背景: HIF-1a作為缺氧標志物,可以與神經膠質瘤患者中miR-301a的表達進行比較。
目的:檢測  exo-miR-301a在缺氧人GBM中的潛在功能。

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 圖1. miR-301a被缺氧GBM細胞特異性表達和分泌,并通過外來體分泌轉到含氧量正常的神經膠質瘤細胞。(A)在高HIF-1a水平的患者中觀察到miR-301a高表達(B)exo-miR-301a與HIF-1a的表達正呈相關。(C)ELISA結果顯示GBM細胞通過增加細胞核中 HIF-1a的水平來應對缺氧微環境變化。(D)Western印跡檢測在含氧量正常或缺氧條件下GBM細胞的外泌體標志物CD9,CD63,CD81和HSP70,與常氧細胞相比,缺氧條件下細胞分泌的外泌體標志物蛋白的表達水平均升高。(E)通過納米粒子追蹤分析檢測到缺氧條件下,外泌體的分泌量增多。(F,G,H) 為了研究不同條件下的 HIF-1a與miR-301a和exo-miR-301a的關系。通過缺氧和HIF-1a干擾RNA(siRNA)處理GBM細胞,缺氧條件下miR-301a和exo-miR-301a的表達顯著增加;同時,HIF-1a的下調顯著降低了miR-301a和exo-miR-301a的表達。總之,該文獻證明了exo-miR-301a是由GBM細胞缺氧下特異性分泌并且與 HIF-1a呈正有關。
、缺氧膠質瘤細胞的 exo-miR-301a直接靶向常氧膠質瘤細胞中的 TCEAL7
背景: TCEAL7是腫瘤抑制基因。
目的:探索miR-301a在缺氧性膠質瘤中的潛在機制,運用軟件Targetscan預測miR-301a的靶基因,探索miR-301a調控靶基因 TCEAL7的機制。

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檢測膠質瘤患者exo-miR-301a和TCEAL7的相關性。TCEAL與miR-301a的表達水平呈負相關。
(A)miR-301a與 TCEAL7基因 3’端UTR含有兩個高度保守的靶位點,第一個是結合位點。(B)As-miR-301a或NC轉染pGL3-WT-TCEAL7-3 UTR-Luc和pGL3-MUT-TCEAL7-3 報告體。在常氧和缺氧條件下,用As-miR-301a轉染導致TCEAL7表達顯著降低。(C)蛋白質印跡分析檢測用As-miRNA-301a轉染后在常氧和缺氧條件下神經膠質瘤細胞中TCEAL7的表達降低。(D)熒光素酶報告基因表明與對照和常氧外泌體組相比,缺氧外泌體組熒光素酶活性降低。(D)相對于常氧條件下,缺氧GEM衍生的外泌體TCEAL7的表達降低。(E)As-miR-301a阻止缺氧外泌體對TCEAL7蛋白質下調的回復
三、在GBM惡性腫瘤中TCEAL7的表達下調
背景: 在此課題之前的研究中,在惡性膠質瘤中b-catenin高表達

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(A)免疫組織化學分析顯示TCEAL7的表達水平,并且隨著膠質瘤惡性狀態的提高而下調。(B)qPCR檢測的神經膠質瘤和正常腦組織中的TCEAL7表達,TCEAL7在膠質瘤組織中的表達低于正常組織中的表達,并且隨著病理分級的升高而降低。(C)Kaplan-Meier生存曲線分析了TCEAL7高表達或低表達的神經膠質瘤患者,高  TCEAL7表達患者的存活率顯著高于TCEAL7表達低的患者。(D)蛋白質印跡檢測TCEAL7的表達水平,與空載體(EV)相比,TCEAL7載體組中TCEAL7蛋白水平顯著增加。(E)TCEAL7顯著抑制膠質瘤細胞的細胞活力。(F)轉染TCEAL7載體的細胞在軟瓊脂上形成的菌落顯著少于對照組。(G)TCEAL7顯著降低GBM侵襲能力。(H)TCEAL7誘導的GBM細胞凋亡。(I)建立了皮下移植瘤模型,前9天兩組腫瘤大小無顯著差異 ;然而,從第10天開始,與對照組相比, TCEAL7組顯示出異種移植腫瘤的大小顯著降低。
四、TCEAL7通過與b-catenin結合而影響b-catenin的穩定性來負調控Wnt / b-catenin途徑

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 (A-B): TCEAL7通過與b-catenin結合卻不抑制b-catenin(A和B)的穩定性來負調節Wnt / b-catenin途徑。首先研究TCEAL7過表達對 b-catenin / T細胞因子( TCF)轉錄活性的影響,這是由  TOP和FOP FLASH在H4細胞中進行的。添加  b-連環蛋白顯著增強了TOP FLASH活性,但沒有FOP  FLASH活性。然而,TCEAL7的過表達以劑量依賴的方式抑制了 b-catenin刺激的TOP  FLASH報告基因的激活。(C)TCEAL7的敲減促進了Wnt靶基因的表達。(D)蛋白質印跡檢測TCEAL7過表達不會抑制b-catenin水平。(E)CHX追蹤實驗結果顯示與對照細胞相比,過表達  TCEAL7的細胞中b-catenin沒有顯著變化。用CHX(20mg / mL)處理細胞指定的小時。(F)純化的TCEAL7和b-連環蛋白之間的相互作用。(G)免疫沉淀測定法檢查異位表達的b-catenin和TCEAL7之間的相互作用。(H)免疫沉淀測定法檢查內源性b-catenin和TCEAL7之間的相互作用。(I)免疫熒光檢測到b-catenin從細胞質轉移到細胞核。
五、低氧膠質瘤細胞產生的exo-miR-301a向常氧膠質瘤細胞轉移,并通過靶向TCEAL 7增強wnt/b-catenin信號

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(A)從低氧外泌體孵育的含氧量正常的細胞中提取RNA并分析miR-301a水平。(B)從不同來源的缺氧外泌體孵育24小時(或作為對照的PBS)的含氧量正常的細胞中提取的RNA分析pri-miR-301a或pre-miR-301a的水平。(C)存在或不存在5,6-二MCB并咪唑1-bD-呋喃核糖苷(DRB)(20mM)的情況下,將缺氧分泌的外泌體喂養到含氧量正常的細胞中。24小時后,分析從受體細胞中提取的RNA的miR-301a水平。(D)用miR-301a模擬物,TCEAL7載體,As-miR-301a或si-TCEAL7處理神經膠質瘤細胞,并且TOP / FOP測定檢測Wnt / b-連環蛋白信號傳導的活性。(E)用As-miR-301a或TCEAL7  siRNA處理缺氧神經膠質瘤細胞,并且TOP / FOP測定檢測Wnt/ b-連環蛋白信號傳導的活性。(F)進行蛋白質印跡分析以評估細胞核和細胞質中b-catenin的蛋白質水平。
六、miR-301a參與低氧外泌體共培養的神經膠質瘤細胞的放射增敏作用。
目的:探究缺氧exo-miR-301a是否介導膠質瘤細胞的放射增敏作用。

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(A)在 0-8Gy的劑量范圍內暴露于輻射后檢測細胞的存活曲線。 MTT和克隆形成結果顯示,與常氧細胞相比,缺氧外泌體組呈現出輻射抗性并且輻射誘導的存活率沒有顯著降低。此外, miR-301a的下調或TCEAL7的增加顯著增加細胞對輻射的敏感性(  p <0.01)。(B)與常氧外泌體組相比,缺氧外泌體組不能進一步抑制細胞活力;轉染As-miR-301a或TCEAL7時,結果相反。(C)流式細胞實驗檢測miR-301a對照射后細胞凋亡的影響。(D)常氧外泌體培養組中 4-或8-Gy照射誘導的凋亡細胞百分比顯著高于缺氧外泌體組,當伴隨 As-miR-301a或TCEAL7時,細胞凋亡能力恢復。向量。為了促進體外實驗,通過使用  U87神經膠質瘤細胞系建立皮下腫瘤以進一步評估 miR-301a在低氧膠質瘤的輻射抗性中的作用。在異種移植物生長測定中,與對照組相比,單獨放射不能顯著降低缺氧外泌體組中的腫瘤生長,并且通過體外檢測觀察到 As-miR-301a或TCEAL7載體增強腫瘤抑制的作用。( E)qPCR以檢查由 Wnt / b-連環蛋白途徑轉錄調節的mRNA水平。Wnt  / b-catenin下游基因在缺氧外泌體條件下被激活;然而,As-miR-301a或TCEAL7可顯著抑制過表達。** p<0.01。

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