揭秘一種新的circRNA,通過海綿miRNA調節mRNA的表達進而影響膀胱癌的進展
欄目:最新研究動態 發布時間:2019-10-16
膀胱癌是泌尿系統最常見的惡性腫瘤,也是世界上最流行的惡性腫瘤之一。在中國,膀胱癌的死亡率和發病率在所有泌尿系統腫瘤中排名第一......

膀胱癌是泌尿系統最常見的惡性腫瘤,也是世界上最流行的惡性腫瘤之一。在中國,膀胱癌的死亡率和發病率在所有泌尿系統腫瘤中排名為第一。根據腫瘤侵襲的深度,膀胱癌可分為兩類:非肌肉侵襲性腫瘤(70~80%)和肌層浸潤性腫瘤(20~30%)。對于肌層浸潤性膀胱癌患者,轉移的發生更為頻繁,預后較差。即使在接受手術和化療最佳治療的肌肉浸潤性膀胱癌患者中,由于遠處轉移,5年總生存率僅為60%。因此,闡明推動膀胱癌進展的分子機制具有重要的臨床意義,這將有助于開發更有效的抗癌療法。
circRNA是一類新的內源性非編碼RNA分子,其基本特征為共價閉環結構,沒有5'帽和3'poly尾。與線性RNA不同,circRNA通常源自外顯子或內含子的反向剪接事件。反向互補序列(包括反向重復Alu對和外顯子跳躍)有助于circRNA形成。circRNAs的顯著特征包括強穩定性,高豐度,進化保守和組織特異性表達。盡管多年前報道circRNA,但這些分子首先被認為是剪接錯誤的產物。RNA測序數據的全基因組分析已經鑒定出大量的circRNA,并證明它們在哺乳動物細胞中是內源的,豐富的和保守的。近年來已經鑒定出circRNA的多種特性,由于一些circRNA具有miRNA結合位點,其作為“miRNA海綿”的作用最常被討論。CircRNAs海綿miRNA來阻止其對靶基因的調節。然而, circRNA在膀胱癌中的作用很少被報道。膀胱癌中circRNA的生物學功能很大程度上未知,需要進一步研究。
6月份,Lu Q等人發表一篇“Circular RNA circSLC8A1 acts as a sponge of miR-130b/miR-494 in suppressing bladder cancer progression via regulating PTEN”的SCI文章,IF=10.679,這項研究鑒定了源自SLC8A1基因的circRNA,稱為circSLC8A1。circSLC8A1的表達在膀胱癌組織和細胞系中顯著下調,并且與膀胱癌的臨床分期和分級呈正相關。這篇文獻也提出了假設,即circSLC8A1可能通過海綿miR-130b和miR-494來影響PTEN的表達參與膀胱癌的進展。
技術路線:

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一、circSLC8A1(hsa_circ_0000994)在膀胱癌中顯著下調

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圖1A.circSLC8A1在膀胱癌組織和細胞系中顯著下調。示意圖顯示了形成circSLC8A1的SLC8A1外顯子1的環化。RT-PCR證實了circSLC8A1的存在,Sanger測序驗證其反向剪接位點。紅色箭頭表示circSLC8A1的特殊剪接位點。BCqRT-PCR實驗證實了與其鄰近的正常組織相比,70對人膀胱癌組織中circSLC8A1表達水平降低。D.qRT-PCR檢測SV-HUC-1和膀胱癌細胞系中circSLC8A1的表達水平。E.RT-PCR在5637和T24細胞系中驗證circSLC8A1的表達情況。引物擴增cDNA中的circSLC8A1但不擴增基因組DNA(gDNA),GAPDH作為陰性對照。F.qRT-PCR檢測RNaseR處理或不處理后的5637和T24細胞中circSLC8A1和SLC8A1mRNA的表達情況。將circSLC8A1和SLC8A1mRNA的相對水平標準化為模擬處理中測量的值。數據是平均值±SD,n=3。

二、過表達circSLC8A1抑制膀胱癌細胞遷移和侵襲

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圖2 過表達circSLC8A1抑制膀胱癌細胞遷移和侵襲。A. 轉染circSLC8A1或對照質粒后,qRT-PCR檢測5637和T24細胞中circSLC8A1和SLC8A1mRNA的表達水平。B. wound healing實驗檢測在5637和T24細胞中circSLC8A1對細胞遷移能力的影響。CD. 轉染circSLC8A1或對照質粒后, transwell遷移和侵襲實驗檢測在5637和T24細胞中circSLC8A1對細胞遷移和侵襲能力。E. 5637和T24細胞轉染兩種sicircSLC8A1,qRT-PCR檢測每種sicircSLC8A1對circSLC8A1和SLC8A1mRNA的干擾效率。F. wound healing實驗檢測在5637和T24細胞中sicircSLC8A1-1對細胞遷移能力的影響。GH transwell遷移和侵襲實驗檢測在5637和T24細胞中circSLC8A1敲減后對細胞遷移和侵襲能力的影響。數據是平均值±SD,n=3。
三、circSLC8A1 充當膀胱癌細胞中 miR-130b 和 miR-494 的海綿

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圖 3 circSLC8A1 充當膀胱癌細胞中 miR-130b 和 miR-494 的海綿。A和B. 通過Pulldown下拉并用circSLC8A1 特異性探針富集5637, T24 和 SV-HUC-1 細胞裂解液中的 circSLC8A1,然后通過 qRT-PCR 檢測circSLC8A1 的表達水平, GAPDH 用作陰性對照。C,D 和 E.通過 circSLC8A1 下拉miRNA,并且通過circSLC8A1 探針在 5637 和 T24 細胞中下拉 miR-130b 和 miR-494。 qRT-PCR 檢測 5637, T24 和 SV-HUC-1細胞裂解液中 7 種 候選miRNA的相對水平。F 和 G 將生物素化的 miR-130b 或 miR-494 轉染到 5637 和 T24 細胞中,鏈霉抗生物素蛋白捕獲后,通過 qRT-PCR 定量 circSLC8A1 水平。H 和 I.免疫熒光實驗檢測在 T24細胞中的 circSLC8A1 和 miR-130b / miR-494 的 表達情況。細胞核染成藍色(DAPI), circSLC8A1 染成紅色, miR-130b / miR-494 染成綠色。數據是平均值±SD,n = 3。
四、miR-130b和miR-494通過靶向PTEN促進膀胱癌進展

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圖 4 miR-130b 和 miR-494 通過靶向 PTEN 促進膀胱癌進展。 A和B. qRT-PCR 結果顯示與正常的鄰近膀胱組織相比, 在膀胱癌組織(n = 30)中miR-130b 和 miR-494的表達上調。 C和D Pearson分析顯示 circSLC8A1 和 miR-130b / miR-494 的表達之間呈負相關。 E和 F CCK-8 結果實驗顯示 miR-130b 和 miR-494 促進 5637 和 T24 細胞的增殖。G 和 H Transwell 遷移和侵襲結果表明5637 和 T24 細胞中轉染 miR-130b 或 miR-494 mimics促進細胞遷移和侵襲。IJ. 5637 和 T24 細胞中轉染 anti-miR-130b 或 anti-miR-494 抑制細胞遷移和侵襲。K.通過生物信息學分析預測 PTEN mRNA 的 3'-UTR 中的 miR-130b / miR-494 結合位點。 L.熒光素酶報告基因檢測 miR-130b / miR-494 和 PTEN mRNA 之間的相互作用。M. miR-130b 和 miR-494 分別下調了 PTEN 的蛋白質表達水平。數據是平均值±SD,n = 3
五、circSLC8A1通過靶向miR-130b和miR-494調節PTEN表達并抑制膀胱癌進展

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圖 5 circSLC8A1 通過靶向 miR-130b 和 miR-494 調節 PTEN 表達并抑制膀胱癌進展。 A,B和 C. Transwell和 CCK-8 實驗證明circSLC8A1 抑制 5637 和 T24 細胞的侵襲能力和增殖,然而用 miR-130b 或 miR-494 共轉染細胞時,抑制作用被逆轉。D 和 E. 蛋白質印跡顯示, miR-130b 和 miR-494 可以部分降低 PTEN 蛋白的表達水平,這是由 circSLC8A1 促進的。 F. 蛋白質印跡分析 10 個配對的人膀胱癌標本和正常相鄰組織樣本中的 PTEN 蛋白。數據是平均值±SD,n = 3。
六、circSLC8A1抑制體內膀胱癌腫瘤的生長

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圖 6 circSLC8A1 抑制體內膀胱癌腫瘤的生長。A. circSLC8A1 或對照載體穩定轉染的 T24 細胞的皮下注射到裸鼠中,建立皮下異種移植腫瘤(每組 n = 6)。 B. 裸鼠中異種移植物腫瘤形成的代表圖。 C.D. 與對照載體組相比,circSLC8A1 處理的裸鼠腫瘤生長速度和體重明顯下降。E.通過 qRT-PCR 在腫瘤組織中檢測circSLC8A1, miR-130b 和 miR-494 的表達水平。F. 在異種移植物中使用 IHC 染色測量 PTEN, AKT,p-AKT 和 MMP9 的表達.

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